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Trial clinici sulla SMA
Trial clinici in essere e futuri sulla SMA
Per quanto è stato detto in precedenza riguardo agli aspetti molecolari della SMA, in questa patologia abbiamo una carenza della proteina SMN dovuta prevalentemente alla delezione del gene SMN1 ed una eventuale compensazione del gene SMN2. Ne consegue che le strategie per tentare di curare questa malattia debbano essere volte ad aumentare i livelli intracellulari di SMN specialmente a livello dei motoneuroni.
Vari approcci in questo senso possono essere utilizzati:
- Aumento dei trascritti di SMN2 agendo a livello del suo promotore;
- Riduzione degli eventi di exonskipping a carico dell’esone 7 del gene SMN2;
- Stabilizzazione della proteina SMN.
Un altro fronte di intervento è quello che coinvolge la possibilità di neuroproteggere i motoneuroni ed infine, se le strategie precedenti non sono attuabili, un’ulteriore possibilità consiste nel tentativo di sostituire i neuroni danneggiati.
Aumento dei trascritti di SMN2 agendo a livello del promotore
È ben noto che lo stato di condensazione della cromatina è molto importante per l’espressione genica. Più la cromatina è condensata ed impacchettata meno è probabile che un gene che ne è contenuto sia trascritto. La condensazione della cromatina è controllata da un sistema costituito da due enzimi: l’istone acetil transferasi che aumenta la trascrizione attraverso il rilassamento della cromatina e l’istone deacetilasi che invece porta ad un maggiore impacchettamento e quindi una riduzione della trascrizione.
Da questo consegue che molecole in grado di inibire l’istone deacetilasi possono essere dei buoni candidati per aumentare i livelli di espressione di SMN2 (1). Tra questi composti il sodio butirrato, che fu usato per la prima volta nel 2001, si è mostrato in grado di indurre un sorprendente aumento dei livelli di trascritto SMN2 contenente anche l’esone 7 (che chiameremo full-length o completo, fl-SMN2) in linee cellulari derivate da pazienti SMA e in topi knockout transgenici (2). Benché l’utilizzo del sodio butirrato non sia auspicabile in pazienti a causa di problematiche farmacocinetiche, di sicuro queste ricerche hanno aperto una nuova strada per il trattamento della SMA.
Altre molecole sono state poi usate con gli stessi intenti: il sodio 4 fenilbutirrato (trial STOP SMA, vedi tabella) è stato utilizzato in studi in vitro e in trial clinici inducendo un miglioramento della funzione del motoneurone in pazienti SMA II aumentando sia i livelli di trascritto fl-SMN2 sia della proteina (3), ma a causa di problematiche farmacocinetiche il suo utilizzo clinico è riservato.
L’inibitore dell’istone deacetilasi che più è stato studiato per il trattamento della SMA è l’acido valproico (VPA). Questa molecola è particolarmente interessante in quanto già clinicamente in uso per il trattamento dell’epilessia e quindi è già stata testata per quel che concerne la sicurezza sui pazienti. Il valproato ha un tempo di dimezzamento ematico di 8-10 ore (cioè la sua concentrazione ematica si dimezza in 8-10 ore) contro i 6 minuti del sodio butirrato. La somministrazione di VPA in dosi terapeutiche (0.5–1000 μM) su fibroblasti di pazienti SMA per un periodo di 16 ore ha determinato l’aumento del mRNA fl-SMN2 da 2 a 4 volte, ed una risposta anche maggiore c’è stata per fibroblasti di pazienti con un maggiore numero di copie di SMN2 anche a base dosi di VPA (4, 5). Nel trial clinico Carni-val il VPA viene somministrato contemporaneamente alla carnitina (vedi tabella).
Altri inibitori degli istoni deacetilasi come Trichostatin A, Vorinostat, M344 benzamide, MS-275, m-Carboxycinnamic acid, bis-Hydroxamide sono stati utilizzati in recenti studi (6, 7) prevalentemente su modelli animali mentre gli studi clinici sono appena iniziati o stanno iniziando.
Riduzione degli eventi di exonskipping a carico dell’esone 7 del gene SMN2
Un altro tipo di approccio per il trattamento della SMA consiste nell’eliminare l’exon-skipping dell’esone 7 del gene SMN2 per rendere più cospicua la frazione di fl-SMN.
Tra i primi composti che sono stati utilizzati (ancora su modelli animali) troviamo il vanadato di sodio che, utilizzato ad una concentrazione di 50 μM per 10-24 ore, determina la massima produzione di trascritto fl-SMN grazie all’induzione di fenomeni di fosforilazione proteica indotti dal vanadato (8). Effetti simili possono essere riscontrati anche grazie all’azione di inibitori delle istone deacetilasi (2)
La stabilizzazione delle proteine SMN
Sono stati vagliati circa 47000 molecole chimiche allo scopo di identificare delle molecole capaci di aumentare i livelli di proteina SMN. L’indoprofene, un farmaco antinfiammatorio non steroideo è in grado di aumentare i livelli della proteina SMN del 13% (9) in modelli cellulari di SMA, studi che però non hanno raggiunto ancora la fase di trial clinico. Altri target potrebbero essere i complessi responsabili della degradazione proteica come il proteosoma.
Ad oggi un solo trial clinico su pazienti SMA I è stato condotto (10) utilizzando riluzolo, il quale si è rivelato senza efficacia in questi pazienti (11).
Riguardo ai trial su pazienti SMA II e III, sono stati compiuti 3 trials; utilizzando Gabapertina (12), utilizzando il fattore di rilascio dell’ormone Tireotropina (13), utlizzando il fenil butirrato (14).
Altri trials, come riportati nella tabella di cui sotto, sono in corso oppure sono conclusi.
Interessante è il trial trophos (Olesoxime) che sembra particolarmente promettente e che terminerà nel 2013
Tabella trials:
|
Trattamento e nome del Trial |
Tipo |
Età al |
Numero di pazienti inclusi |
Tipo di trial |
Durata del trial (inizio-fine) |
Efficacia |
|
Riluzolo (ASIRI) |
SMA II e III |
6–20 |
141 |
Doppio cieco-placebo |
24 mesi (1-2006– 12 2009) |
Funzione motoria (Scala MFM), Funzione polmonare (FVC), misura dell’indipendenza funzionale |
|
Idrossi urea |
SMA II e III |
>4 |
60 |
Doppio cieco-placebo |
24 mesi (Giugno 2007– Giugno 2009) |
FL SMN mRNA, Proteina SMN Funzione motoria, funzione polmonare |
|
Acido valproico e carnitina (CARNI-VAL) |
SMA I |
2–12 mesi |
36 |
Studio aperto |
13 mesi (Luglio 2007– Dicembre 2009) |
Sicurezza, età alla morte livelli di proteina e trascritto anche nel Sistema nervoso centrale |
|
Acido valproico) (VALIANT SMA)
|
SMA III |
18–60 mesi |
33 |
Doppio cieco-placebo |
12 mesi (Apr 2008– Giugno 2010) |
Forza muscolare, funzione polmonare capacità di camminare, numero di copie di SMN2 |
|
Sodio fenilbutirrato (STOP SMA) |
SMA I |
0–3 mesi (≤3 SMN2 copie) |
12 |
Studio aperto |
18 mesi (Giugno 2007–Dic 2011) |
Funzione motoria Livelli di SMN in pazienti presintomatici ma diagnosticati SMA |
|
Sodio fenilbutirrato (STOP SMA) |
SMA II e III |
Senza limiti |
90 |
Osservazionale |
Dal 2005 |
Osservazionale storia naturalel Natural history |
|
Olesoxime |
SMA II e III |
3–25 |
~150 |
Doppio cieco-placebo |
24 mesi e open-label (2010–2013)† |
Funzione motoria Funzione polmonare |
Modelli Animali
Il gene SMN2 è, come sappiamo presente solo nella specie umana. Altri primati presentano numerose copie del loro gene SMN, quindi anche una mutazione su una di esse non porta alle problematiche che si riscontrano sull’uomo.
La mancanza assoluta della proteina SMN è incompatibile con la vita come è stato dimostrato da esperimenti condotti sul topo nei quali l’unico gene Smn veniva eliminato (knockout del gene) e ciò portava alla letalità embrionale (15). In animali inferiori comunque l’elevato contributo materno allo sviluppo dell’embrione può ovviare a questa mancanza nell’embrione stesso. Tra i modelli più utilizzati ricordiamo una mosca della frutta (Drosophila melanogaster), un verme (Caenorhabditis elegans) ed il pesce zebra (Danio rerio) (16-18). In alcuni modelli le mutazioni a carico del gene Smn sono spontanee mentre in altri casi vengono indotte con strumenti di biologia molecolare come l’introduzione di trasposoni, RNA interference e antisensi morfolino.
Alterazioni del gene smn nel pesce zebra determinano il cambiamento della capacità dei motoneuroni di trovare il loro bersaglio; nella drosophila riduce la formazione dei bottoni a livello della giunzione neuromuscolare; nel verme C. elegans causa difetti di locomozione anche se senza difetti morfologici ma con una letalità qualora il gene venga completamente eliminato.
Modelli murini di SMA
Come è stato precedentemente accennato il topo ha un solo gene Smn che qualora eliminato porta ad una letalità embrionale (15) che non è molto utile come modello della SMA I, II, III. A tale scopo negli anni 2000 sono stati prodotti due modelli: nel primo (19) veniva eliminato in maniera condizionale l’esone 7 nel gene Smn del topo (cioè poteva essere eliminato a discrezione del ricercatore utilizzando una stimolazione farmacologica). Questo determinava la perdita di motoneuroni, atrofia muscolare e la morte intorno al venticinquesimo giorno di vita post natale (P25). In un secondo modello creato per mimare in maniera più precisa la patologia ed in particolare per mantenere lo splicing aberrante che si verifica nell’uomo per SMN2 è stato inserito un frammento di DNA genomico umano contenente il gene SMN2 nel topo KO per Smn (20, 21). In questo modo fu possibile ottenere un recupero del fenotipo cioè ottenere animali che sopravvivevano alla nascita. Questi animali erano praticamente indistinguibili rispetto ai loro fratelli sani ma iniziavano a sviluppare dal secondo giorno dalla nascita un fenotipo caratterizzato dalla scarsa capacità di succhiare il latte materno, taglia ridotta e progressiva debolezza, mentre la morte attorno a P4. La presenza di più copie di Smn2 (8 copie) determinava il completo recupero del fenotipo normale in topi che mancavano del gene Smn (20).
A cura di:
Daniele Bottai
Università degli studi di Milano
Professore aggregato
Dipartimento di Medicina, Chirurgia e Odontoiatria
Ospedale San Paolo via A. di Rudinì 20142
Milano, Italia
Tel 0039-02-503 23286
Fax 0039-02-503 23033
E-mail:
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Referenze
1. Kernochan LE, Russo ML, Woodling NS, et al. (2005) The role of histone acetylation in SMN gene expression. Hum Mol Genet 14: 1171-1182.
2. Chang JG, Hsieh-Li HM, Jong YJ, Wang NM, Tsai CH, Li H. (2001) Treatment of spinal muscular atrophy by sodium butyrate. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 9808-9813.
3. Brahe C, Vitali T, Tiziano FD, et al. (2005) Phenylbutyrate increases SMN gene expression in spinal muscular atrophy patients. Eur J Hum Genet 13: 256-259.
4. Brichta L, Hofmann Y, Hahnen E, et al. (2003) Valproic acid increases the SMN2 protein level: a well-known drug as a potential therapy for spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet 12: 2481-2489.
5. Sumner CJ, Huynh TN, Markowitz JA, et al. (2003) Valproic acid increases SMN levels in spinal muscular atrophy patient cells. Ann Neurol 54: 647-654.
6. Avila AM, Burnett BG, Taye AA, et al. (2007) Trichostatin A increases SMN expression and survival in a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest 117: 659-671.
7. Hahnen E, Hauke J, Trankle C, Eyupoglu IY, Wirth B, Blumcke I. (2008) Histone deacetylase inhibitors: possible implications for neurodegenerative disorders. Expert Opin Investig Drugs 17: 169-184.
8. Zhang ML, Lorson CL, Androphy EJ, Zhou J. (2001) An in vivo reporter system for measuring increased inclusion of exon 7 in SMN2 mRNA: potential therapy of SMA. Gene Ther 8: 1532-1538.
9. Lunn MR, Root DE, Martino AM, et al. (2004) Indoprofen upregulates the survival motor neuron protein through a cyclooxygenase-independent mechanism. Chem Biol 11: 1489-1493.
10. Russman BS, Iannaccone ST, Samaha FJ. (2003) A phase 1 trial of riluzole in spinal muscular atrophy. Arch Neurol 60: 1601-1603.
11. Bosboom WM, Vrancken AF, van den Berg LH, Wokke JH, Iannaccone ST. (2009) Drug treatment for spinal muscular atrophy type I. Cochrane Database Syst Rev: CD006281.
12. Miller RG, Moore DH, Dronsky V, et al. (2001) A placebo-controlled trial of gabapentin in spinal muscular atrophy. J Neurol Sci 191: 127-131.
13. Tzeng AC, Cheng J, Fryczynski H, et al. (2000) A study of thyrotropin-releasing hormone for the treatment of spinal muscular atrophy: a preliminary report. Am J Phys Med Rehabil 79: 435-440.
14. Mercuri E, Bertini E, Messina S, et al. (2007) Randomized, double-blind, placebo-controlled trial of phenylbutyrate in spinal muscular atrophy. Neurology 68: 51-55.
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=9275227
16. Chan YB, Miguel-Aliaga I, Franks C, et al. (2003) Neuromuscular defects in a Drosophila survival motor neuron gene mutant. Hum Mol Genet 12: 1367-1376.
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