Settembre 2006
Preparazione di cellule staminali neurali da espianti cutanei di pazienti affetti da atrofia muscolare spinale e studio molecolare degli effetti di farmaci su proteine SMN2
Di Daniele Bottai Ph.D.
Assistant Professor in Pharmacology
Dept. Medicine, Surgery and Dentistry - Faculty of Medicine, University of Milan

Scopo del progetto.
Lo scopo di questo progetto è la produzione di cellule staminali neuralizzate da derma umano allo scopo di rendere disponibili modelli cellulari per lo studio ed il trattamento farmacologico dell’atrofia muscolare spinale.

Razionale del progetto
Il progetto si articola essenzialmente in due fasi.
Inizialmente produrremo cellule staminali dalla pelle di persone sane per mettere a punto le condizioni di isolamento e coltura, successivamente le neuralizzeremo (NSSCs) allo scopo ottenere delle cellule con caratteristiche morfofunzionali simili alle cellule staminali neurali (NSC). Infatti già alcuni anni fa nel laboratorio di Brenda Miller sono state prodotte cellule da derma che sono state indotte ad assumere le caratteristiche delle NSC (Toma et al., 2001). Messe a punto queste condizioni passeremo ai pazienti ed ai loro genitori. La neuralizzazione è un processo importante in quanto le cellule staminali neurali che produrremo saranno in grado di produrre cellule del cervello adulto, come ad esempio gli astrociti, gli oligodendrociti ed i neuroni, in particolare i motoneuroni che rappresentano le cellule colpite dalla SMA.
In una seconda fase del progetto utilizzeremo le cellule prodotte (NSSCs) per fare uno screening di numerosi farmaci allo scopo di individuarne alcuni che siano capaci di indurre l’espressione di smn2. In particolare studieremo gli effetti di questi farmaci sia sulle cellule in fase di proliferazione che su quelle differenziate (in neuroni, oligodendrociti e astrociti). Tra i farmaci che intendiamo testare particolare interesse rivestiranno farmaci inibitori delle deacetilasi che sono stati già indicati aumentare i livelli della proteina smn2 funzionale.

Protocollo Sperimentale.
Il protocollo può essere schematizzato come di seguito riportato:
a) Preparazione delle NSSCs da individui umani adulti sani.
b) Preparazione delle NSSCs da pazienti affetti da SMA e/o da loro genitori. A tale scopo sono stati presi accordi con l’associazione per lo studio delle Atrofie Muscolari Spinali Infantili (ASAMSI) per avere la disponibilità di biopsie da pazienti e loro genitori. Queste biopsie verranno condotte nell’Unità Operativa di Dermatologia dell’Ospedale San Paolo.
c) Caratterizzazione delle NSSCs da un punto di vista proliferativo e differenziativo e loro comparazione con NSC fetali umane. A tale scopo allestiremo i seguenti campioni:

d)Trattamento delle NSSCs con differenti farmaci ed in particolare inibitori delle deacetilasi, per i quali esistono già evidenze a favore della loro capacità d’influire sull’espressione del gene smn2.
I farmaci che saranno testati sulle cellule sono: fenil-butirrato (Andreassi et al., 2004), sodio-butirrato (Brichta et al., 2003), sodio vanadato, aclarubicin (Andreassi et al., 2001), acido valproico (Brichta et al., 2003), ibuprofen (Kudo et al., 2003), indoprofen (Lunn et al., 2004), SAHA (Hahnen et al., 2006), CBHA (Hahnen et al., 2006), MS-275 (Hahnen et al., 2006), M344 (Hahnen et al., 2006), Tricostatina A (TSA) (Zou et al., 2004), o loro varie combinazioni
e) Su tutti i tipi di campioni sopra elencati studieremo l’analisi dell’espressione del mRNA per il gene SMN2 nonché di altre proteine che sembrano coinvolte nella patologia come NAIP (fattore neurale inibente l’apoptosi),  Hif 1a (fattore inibitore l’ipossia) che è coinvolta in numerose vie di proliferazione e differenziamento e dei fattori apoptotici quale ad esempio la caspasi 3.
f) Analisi citofluorimetrica di numerosi markers sia di staminalità che di differenziamento quali: Syndecan-1; Notch-1; Integrin a 6; Integrin b1; NCAM/CD56; CD90; CD15; 57D2; W4A5; Nestin; Fibronectin; Vimentin; CD164; NGFR; Prominin-1; CD172; W8C3; b III-tubulin; MAP2; GAP-43; P75NTR; NF-M; GFAP; O4 Ganglioside; Galactocerebroside; MHC Class I; MHC Class II; Tyrosinase. Inoltre effettueremo uno studio dell’apoptosi mediante citofluorimetria tramite il saggio del legame delle cellule con annessina V o Tunnel, uno studio delle fasi del ciclo cellulare e della proliferazione ed un’analisi della "side population" per le cellule immature.

Con questo nuovo strumento saremo in grado di studiare le risposte dei motoneuroni ma anche delle cellule staminali neurali senza estrarre tali cellule dal sistema nervoso centrale del paziente. Attualmente la maggior parte degli studi in vitro sono stati effettuati usando i fibroblasti dei pazienti che ovviamente hanno un comportamento fisiologico differente dalle cellule nervose, il nostro studio quindi ha le potenzialità per produrre un nuovo modello in vitro che permetta un rapido screening farmacologico sulle cellule “neurali“ affette da SMA.

Referenze
Andreassi C, Jarecki J, Zhou J, Coovert DD, Monani UR, Chen X, Whitney M, Pollok B, Zhang M, Androphy E, Burghes AH (2001) Aclarubicin treatment restores SMN levels to cells derived from type I spinal muscular atrophy patients. Human molecular genetics 10:2841-2849.
Hahnen E, Eyupoglu IY, Brichta L, Haastert K, Trankle C, Siebzehnrubl FA, Riessland M, Holker I, Claus P, Romstock J, Buslei R, Wirth B, Blumcke I (2006) In vitro and ex vivo evaluation of second-generation histone deacetylase inhibitors for the treatment of spinal muscular atrophy. J Neurochem 98:193-202.
Kudo C, Kori M, Matsuzaki K, Yamai K, Nakajima A, Shibuya A, Niwa H, Kamisaki Y, Wada K (2003) Diclofenac inhibits proliferation and differentiation of neural stem cells. Biochem Pharmacol 66:289-295.
Lunn MR, Root DE, Martino AM, Flaherty SP, Kelley BP, Coovert DD, Burghes AH, Man NT, Morris GE, Zhou J, Androphy EJ, Sumner CJ, Stockwell BR (2004) Indoprofen upregulates the survival motor neuron protein through a cyclooxygenase-independent mechanism. Chemistry & biology 11:1489-1493.
Toma JG, Akhavan M, Fernandes KJ, Barnabe-Heider F, Sadikot A, Kaplan DR, Miller FD (2001) Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol 3:778-784.
Zou J, Barahmand-pour F, Blackburn ML, Matsui Y, Chansky HA, Yang L (2004) Survival motor neuron (SMN) protein interacts with transcription corepressor mSin3A. The Journal of biological chemistry 279:14922-14928.

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