| |
Febbraio 2004
Progetto SMA
Direttore del progetto: Angelo L. Vescovi
DIBIT, Ospedale San Raffaele, via Olgettina 58, 20132 Milano, Italy
L'atrofia muscolare spinale infantile (SMA) è una malattia genetica autosomica caratterizzata dall’eccessiva degenerazione di motoneuroni del midollo allungato e del midollo spinale risultante in un progressivo indebolimento e perdita dei muscoli volontari.
La SMA può essere classificata sulla base del decorso clinico in tre tipi:
- tipo I (malattia di Werdnig-Hoffmann)
- tipo II (forma intermedia)
- tipo III (malattia di Kugelberg-Welander)(Dubowit z et al., 1995).
La forma I è considerata a tutti gli effetti la più acuta e devastante ed è caratterizzata da un inizio precoce, da un’ipotonia dei muscoli volontari e generalmente progredisce in una fatale crisi respiratoria. La SMA di tipo II è meno grave della I e la III è invece considerata come una forma giovanile.
Oltre all'interessamento dei motoneuroni del midollo allungato e del midollo spinale nella forma I pare che ci sia un coinvolgimento dei gangli delle radici dorsali nelle colonne di Clarke e nel nucleo talamico laterale specialmente in soggetti che sopravvivono per relativamente lunghi periodi (Iwata and Hirano,1978).
Solo un limitato numero di studi post-mortem in SMA di tipo III (Aberfeld and Namba, 1969) sono stati effettuati ed hanno indicato l'interessamento dei motoneuroni del corno posteriore e/o dei nuclei dei nervi craniali ed una riduzione delle fibre mielinizzate del fasciculus gracilis.
Tramite analisi genetica vari gruppi di ricerca hanno associato la SMA ad una delezione a carico del cromosoma 5q13, che interessa vari geni tra cui il gene SMN1 (survival motor neuron) (Lefebvre et al, 1995) ed il gene NAIP (apoptosis inhibiting protein) (Roy et al, 1995). Il gene SMN nell'uomo è presente in una forma telomerica SMN1 e parecchie copie centromeriche SMN2. Per comprendere il ruolo funzionale di SMN1 nella SMA sono state prodotte linee murine mancanti di tale gene e linee che invece esprimevano SMN2 umano. Topi Smn-/- morivano nelle fasi precedenti al preimplanto mentre invece topi esprimenti SMN2 in un background Smn-/- mostravano cambiamenti patologici nel midollo spinale e nei muscoli scheletrici simili a quelli dei pazienti SMA.
La severità dei cambiamenti patologici in questi topi correlava con i livelli di espressione delle proteine SMN. Infatti, il gene SMN2 differisce dal gene SMN1 solo per una mutazione che determina uno splicing alternativo che elimina l'esone 7 causando la formazione di una proteina tronca non funzionale. Una frazione dei trascritti di SMN2 è in grado di produrre la proteina funzionante, più copie di SMN2 sono presenti più proteina funzionante viene prodotta con conseguente effetti di “salvataggio” del background Smn-/- (Hsieh-Li et al, 2000).
Inoltre, benché lo stesso SMN ha solo un debole effetto antiapoptotico la coespressione di SMN con Bcl-2 (un'altra proteina antiapoptotica conferisce un effetto sinergico antiapoptotico). Oltre all'apoptosi è'stato speculato che stress ossidativi e/o tossicità da glutammato possano essere coinvolti in malattie a carico dei motoneuroni inclusa la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) (Beal et al, 1997).
Attualmente non ci sono terapie per prevenire il deterioramento progressivo del sistema nervoso centrale (SNC) che si verifica nella SMA o in altre malattie a carico di motoneuroni o glia.
La sostituzione dei motoneuroni degenerati sta emergendo come un approccio terapeutico molto promettente per numerose patologie. Il procedimento classico prevede il trapianto di tessuto da cervello di feto nella regione appropriata del sistema nervoso centrale fetale (Shannon and Kordower, 1996).
Il trapianto di cellule fetali pone molte domande sull'origine del tessuto del donatore e presenta una pletora di questioni morali, pratiche e logistiche. In aggiunta vengono sollevate numerose problematiche di natura etica sull'uso di tessuto fetale molte volte proveniente da numerosi feti. Inoltre la vitalità e la composizione delle cellule del donatore aumenta la possibilità di reazioni immunologiche o contaminazione. Infine l'uso nei trapianti direttamente di materiale fetale non permette un controllo sulla composizione o lo stadio di maturazione delle cellule stesse, due parametri di fondamentale importanza per in completo successo del trapianto (Shoulson et al., 1998). Per queste ragioni è stato proposto l'uso di fonti alternative di cellule come precursori neurali immortalizzati.
La gran parte se non la totalità delle caratteristiche richieste da una fonte ideale di cellule per un trapianto allo scopo di risolvere patologie a carico del SNC, come quelle dei motoneuroni, possono essere trovate nelle cellule staminali neurali.
Il nostro laboratorio è stato coinvolto nello studio delle cellule staminali neurali multipotenti sin dalla loro iniziale scoperta nel 1992. In collaborazione con B. Reynolds e S. Weiss che inizialmente isolarono le cellule staminali “bona fide” dal cervello di topo adulto (Reynolds and Weiss, 1992), abbiamo dimostrato che queste cellule staminali neurali si moltiplicano in uno stato indifferenziato e danno origine a progenitori uni e bipotenti che rispondono al fattore di crescita dei fibroblasti FGF2, e generano sia glia che neuroni elettrofisiologicamente attivi (Vescovi et al., 1993). Durante il corso di questi studi è apparso evidente che fattori multipli, inclusi ormoni steroidei, possono essere coinvolti nella proliferazione e differenziamento delle cellule staminali neurali (NSC) (Gritti et al., 1996; Melcangi et al., 1996).Inizialmente è stato appurato che FGF2 può stimolare l'espressione del recettore per l'EGF in NSC provenienti dallo striato; ciò ci ha suggerito che l'effetto sinergico dei due fattori FGF2 ed EGF potesse essere richiesto dalle NSC umane per indurre una estesa proliferazione ed eventualmente la possibilità di stabilire colture stabili.
Così siamo stati capaci di estendere i nostri iniziali dati a colture umane (Cattaneo et al., 1996) e di provare che differenti zone del SNC contenevano un piccolo ma significante numero di NSC (Vescovi et al .,1999a,b).
Quando il tessuto fetale primario veniva coltivato meno dell' 1% delle cellule sopravviveva, proliferava ed esprimeva il marcatore di precursori del SNC nestina. Abbiamo trovato che queste cellule potevano essere subcoltivate, per un tempo superiore ai due anni in continua presenza di EGF ed FGF2, determinando un incremento esponenziale del numero di cellule. Questo approccio ci ha permesso di produrre linee multiple di cellule staminali neuroepiteliali non trasformate da varie regioni del SNC umano fetale che forniscono una continua fonte di approvvigionamento di precursori neurali umani.
Benché queste cellule siano altamente indifferenziate ne è stata dimostrata la loro multipotenzialità ovvero la loro capacità di generare neuroni, astrociti ed oligodendrociti per un numero molto esteso di passaggi fin oltre il 50esimo.
Dai 3 ai 5 giorni dopo l'induzione del differenziamento, ottenuto piastrando le cellule in assenza di fattori di proliferazione (EGF ed FGF2) vari antigeni tipici della linea neuronale sono espressi la proteina associata ai microtubuli 2 e 5 (MAP2 e 5), la ß-tubulina, la proteina Tau, i neurofilamenti (NF), l'enolasi specifica dei neuroni (NSE); sono inoltre rilevabili il marcatore per la proteina acida fibrillare (GFAP) e i marcatori tipici degli oligodendrociti , il galactocerebroside (GC) e la proteina basica della mielina (MBP). È di particolare rilevanza il fatto che la progenie delle cellule staminali è elettrofisiologicamente attiva ed esprime canali ionici necessari per l'eccitabilità. Infatti neuroni derivanti da cellule staminali neurali umane sono in grado di generare sia spike singoli, in risposta a brevi impulsi di corrente, che treni di potenziali di azione quando eccitati da depolarizzazioni più elevate. Con esperimenti di Voltage-clamp è stato dimostrato che una corrente veloce in ingresso (fast inward) al sodio (Na+) e due correnti al potassio in uscita (una veloce inattivante ed una ritardata rettificante) possono essere registrate in queste cellule. Queste correnti inoltre rispondono a farmaci quali tetradotossina ed AP4 esattamente come accade nei neuroni maturi in vivo o ex vivo.
Sappiamo inoltre che le cellule staminali neurali umane hanno un'altra importante caratteristica ovvero la stabilità delle loro proprietà funzionali.
L'osservazione delle capacità proliferative di cellule staminali preparate da passaggi precoci (10th) o tardivi (40th) ha mostrato che la prima divisione cellulare avviene regolarmente dopo 3-4 giorni in vitro mentre il loro tasso di crescita rimane costante per estesi periodi di tempo di coltura. Ancora di maggior rilevanza è il fatto che la proliferazione di queste NSC umane rimane legata alla presenza di fattori di crescita come l'FGF2 e l'EGF, e la loro rimozione dal terreno di coltura determina il loro differenziamento in neuroni e glia.
Questa capacità differenziativa rimane stabile sia per colture a passaggi precoci che per colture a passaggi tardivi, infatti una comparabile percentuale di neuroni viene prodotta da colture giovani e vecchie (i.e. 13.7± 0.85 e 12.72±0.63 rispettivamente media ± se, n=10), mentre più dell'80% genera astrociti ed il 2% genera oligodendrociti. Dato che questi risultati dimostrano che le hNSC rappresentano una sorgente stabile e rinnovabile di neuroni, astrociti ed oligodendrociti che de facto, eliminano la necessità di un continuo uso di tessuto fetale primario sia per applicazioni sperimentali che cliniche abbiamo cercato di stabilire se fossero idonee per paradigmi di trapianto. A oggi abbiamo dimostrato che le hNSC possono sopravvivere nello striato di topo adulto per oltre un anno. Analisi quantitative di animali sacrificati dopo 4.5 mesi dopo il trapianto hanno rivelato che in media 9.6% delle cellule iniettate sopravvivevano e migravano mediamente di 1.2 mm tangenzialmente e 0.75 mm radialmente dal sito di iniezione.
Esperimenti di doppio marcaggio hanno dimostrato che cellule trapiantate erano differenziate in astrociti immunoreattivi per la GFAP o neuroni immunoreattivi per NSE. È degno di nota il fatto che su più di dodici animali trapiantati nessuno ha mostrato la formazione di tumori nonostante il fatto che fossero in costante immunodepressione tramite somministrazione di ciclosporina. Inoltre hNSC sono state iniettati in topi immunodeficenti e dopo un anno dal trapianto il parenchima dell'ospite si mostrava normale indicando che la minaccia tumorigenica di queste cellule è minima.
In recenti esperimenti abbiamo dimostrato che le hNSC possiedono delle caratteristiche di estrema rilevanza nel contesto del trapianto nel sistema nervoso centrale, ovvero la loro capacità di dar luogo a neuroni che producono specifici neurotrasmettitori in maniera contesto-dipendente. Così, mentre queste hNSC spontaneamente differenziano in neuroni gabaergici o glutammatergici, possono essere indotti ad esprimere fenotipi catecolamminergici, serotoninergici e colinergici (tipici dei motoneuroni), che potrebbero essere usati in terapie trapianto mediate di soggetti affetti da SMA, Parkinson e lesioni spinali traumatiche (SCI). In aggiunta, mentre il numero di neuroni generati durante il differenziamento in vitro è normalmente attorno il 10-15% del numero totale di cellule, l'esposizione a particolari citochine come l'interleuchina 1 (IL1), il fattore neurotrofico proveniente dal cervello (BDNF), o l'FGF9 possono aumentare il differenziamento neurale fino al 50% o più.
Uno dei problemi incontrato nei paradigmi di trapianto in malattie non focali è quello di come le cellule possano raggiungere i numerosi siti di lesione. Nel nostro laboratorio è stato recentemente dimostrato che colture di hNSC da adulto possono raggiungere aree demielinizzate e migliorare i sintomi clinici, neurofisiologici e patologici quando iniettati sia all'interno dei ventricoli (ic) che in maniera sistemica (iv) in modelli animali di sclerosi multipla (MS) l'encefalomielite autoimmune (EAE) (Pluchino et al., 2003). Di nota è il fatto che in entrambi i tipi di trapianto si è ottenuto il recupero clinico in EAE rispetto al relativo controllo, ed inoltre il recupero dipendeva dal tipo di cellule iniettate, infatti solo le NSC ma non i fibroblasti erano in grado di determinare tali miglioramenti clinici. Animali trapiantati con NSC ic iniziavano a recuperare dalla malattia dopo 15 giorni dal trapianto mentre gli animali trapiantati iv iniziavano il loro recupero a 10 giorni dal trapianto.
Scopo del progetto. Sulla base dei sopracitati risultati un possibile approccio per patologie, quali la SMA, ALS ed altre che non sono localizzate ma presentano numerosi foci distribuiti in varie zone del SNC, è il trapianto tramite iniezione endovenosa ipotizzando che queste cellule possano raggiungere (grazie a fattori rilasciati dalla zona danneggiata stessa) le regioni danneggiate sostituendo le cellule malate o rilasciando fattori che contribuiscano alla proliferazione e differenziamento delle cellule staminali neurali endogene.
Un passaggio successivo della nostra ricerca sarà quello di mettere a punto le condizioni tramite le quali le hNSC possano essere indirizzate in aree multiple del SNC. Ciò implicherà che occorrerà trovare i corretti parametri per aprite la barriera ematoencefalica (BBB) permettendo l'ingresso delle cellule trapiantate per iniezione endovenosa.
In un nostro recente studio (Pluchino et al., 2003) la BBB era stata aperta usando un lipopolisaccaride per mimare la situazione infiammatoria simile a quella che si verifica nelle fasi precoci della sclerosi multipla. Potremo usare questo approccio farmacologico per permettere alle hNSC di passare la BBB, ma esistono comunque strategie alternative quali l'uso del mannitolo che produce una riduzione delle dimensioni delle cellule che rivestono la parete dei vasi permettendo il temporaneo ingresso di farmaci e forse di hNSC nel SNC.
Pensiamo di effettuare questi esperimenti inizialmente in ratti usando HNSC isolate da cervello fetale umano (tessuti esclusivamente ottenuti da aborti spontanei) e di saggiare le varie condizioni allo scopo di selezionare quelle che maggiormente permettono l'ingresso delle cellule staminali nel SNC.
In una seconda fase utilizzeremo un approccio analogo usando primati non umani.
Come trial parallelo intendiamo portare avanti una analisi più mirata sulla SMA. A tale scopo pensiamo di effettuare dei trapianti in modelli murini di SMA usando cellule staminali da topo sano (allo scopo di poter riconoscere le cellule del donatore nell'ospite malato useremo cellule staminali che esprimono marcatori facilmente rilevabili nel tessuto dell'ospite come la ß-galactosidasi (ß-Gal) o la proteina fluorescente verde (GFP).
Ad oggi sono disponibili diversi modelli murini di SMA. Comunque a nostro parere il modello che è maggiormente simile alla patologia umana è il topo transgenico che porta un frammento genomico di DNA di 115 kb che comprende la regione del gene umano SMN2 ed include parte della regione centromerica NAIP e tutto il gene SERF1 (precedentemente chiamato H4F5), e che è inoltre omozigote per il gene mutato Smn-/- e che quindi può essere descritto come Smn-/-/hSmn2. (Hsieh-Li et al., 2000).
Questi topi portano una delezione dell'esone 7 di Smn1 ed il transgene umano contenente Smn2 e sviluppano una varietà di sintomi inclusi un peso corporeo inferiore alla media, una coda di breve lunghezza ma pronunciatamente allargata, edema, necrosi cronica della coda e degli arti posteriori, ed una variabile sopravvivenza nella stessa nidiata. La forma più severa chiamata di tipo 1 è caratterizzata da assenza di peli della pelliccia ed una vita media inferiore a 10 giorni. Un fenotipo intermedio (tipo 2) è caratterizzato da scarsa attività motoria e durata di vita di circa 4 settimane. I topi mutanti di tipo tre sopravvivono come gli animali sani ma hanno una coda corta ed allargata. Molto probabilmente queste differenze sono legate al numero di copie del transgene e conseguentemente al numero di copie di Smn2 (come è stato gia descritto nonostante la mutazione del gene SMN2 che porta prevalentemente alla produzione di una proteina tronca piccole quantità di proteina SMN completa vengono prodotte e la loro quantità è funzione del numero di copie del transgene che sono integrate nel genoma).
L'esperimento sarà effettuato come segue: inizialmente si utilizzerà il fenotipo intermedio 2 (ma non escludiamo di utilizzare in seguito anche quello più grave, cioè il tipo 1) (Hsieh-Li et al., 2000) e verranno effettuati dei trapianti usando un appropriato numero di cellule (200000-500000 per animale), ogni iniezione verrà ripetuta settimanalmente nelle prime 4 settimane di vita dell'animale. In ogni nidiata alcuni animali Smn ?7-/- hSMN2 verranno trapiantati con NSC (GFP+ o ß-Gal) ed altri (utilizzati come controlli) saranno trapiantati con fibroblasti o con soluzione salina o addirittura non verranno trattati in alcun modo.
Gli animali saranno monitorati per le loro capacità motorie usando test comportamentali utilizzando ad esempio la scala Basso, Beattie e Bresnahan.
Naturalmente questi esperimenti verranno effettuati in doppio cieco e cioè l'operatore che effettuerà il test comportamentale non sarà a conoscenza del tipo di trapianto a cui è stato soggetto il topo sotto analisi. Infine questi animali a vari tempi dai trapianti saranno sacrificati allo scopo di saggiare il grado di attecchimento delle cellule trapiantate, siano esse GFP o ß-Gal, tramite analisi immunoistochimica.
(Autore: Prof. Angelo Vescovi)
2003
Le cellule neurali fetali sono in grado di ricostruire i tessuti danneggiati
Le cellule staminali sono in grado di ricostruire i tessuti danneggiati e si possono suddividere in due categorie: embrionali e somatiche.
Le cellule somatiche a loro volta si possono distinguere in fetali ed adulte. Per quanto riguarda le cellule umane è possibile lavorare solo su quelle fetali, mentre su quelle di topo si può lavorare sia su quelle fetali che su quelle adulte.
In questa sperimentazione sono state prese in considerazione soprattutto le cellule neurali del tessuto nervoso centrale. Questo tipo di cellule staminali è difficile da prelevare in un individuo adulto vivo, mentre le cellule staminali che si trovano nella pelle e nel sangue sono di più semplice reperibilità.
Le cellule embrionali hanno la potenzialità sia di dividersi, cioè di proliferare, sia di dar luogo a cellule di tutti i tipi di tessuti. Possono essere prelevate da blastocisti (embrione nelle prime fasi dello sviluppo).
Le cellule somatiche adulte hanno una capacità limitata di dar luogo ad altre cellule rispetto a quelle fetali. Il potenziale di differenziamento delle cellule staminali diminuisce durante lo sviluppo dell’organismo. Le cellule del tessuto nervoso possono essere usate per curare patologie del sistema nervoso in quanto si differenziano solamente in cellule neurali (neuroni, oligodendrociti e astrociti). Per questo vengono definite pluripotenti (contrariamente a quelle embrionali che sono totipotenti, cioè capaci di generare tutti i tipi di tessuto). E’ difficile trovare un donatore adulto di cellule staminali neurali in quanto bisognerebbe prelevare una parte del tessuto nervoso presente sulla superficie dei ventricoli (cavità del cervello) e nei bulbi olfattivi. Un modo più semplice sarebbe quello di usare le cellule neurali di un feto abortivo.
Le cellule staminali somatiche fetali sono indifferenziate: hanno una forma rotondeggiante senza particolari prolungamenti e non hanno particolari enzimi. Si dividono in coltura e danno luogo ad un agglomerato di cellule che può essere dissociato in modo che da una cellula staminale se ne possono riprodurre moltissime. Da cellule neurali di un solo feto si può produrre una quantità molto grossa da usare in seguito nei trapianti.
Sulla base dei dati presentati lo scorso anno, si vuol vedere se effettivamente le cellule fetali umane sono in grado di dividersi (quindi se, partendo dal feto, si è in grado di aumentarne il numero). Sono state prelevate cellule dalla corteccia e dal midollo del feto, dissociate e messe in coltura in presenza di fattori di crescita che “fanno credere” alle cellule di trovarsi in una zona danneggiata nel cervello: ciò stimola le cellule a dividersi per riparare il danno.
Da feti di aborti spontanei, ottenuti con l’autorizzazione da parte dei vari ospedali, sono state prelevate cellule della corteccia cerebrale e del midollo. Le cellule sono state dissociate enzimaticamente e meccanicamente; successivamente si è osservato che in coltura sono in grado di moltiplicarsi velocemente (ad esempio le cellule del diencefalo raddoppiano di numero in 7 giorni, quelle della corteccia e del midollo in 10-12 giorni). La variabilità dei tempi di divisione cellulare può dipendere da vari fattori ancora poco conosciuti: una motivazione potrebbe essere che tra il momento dell’aborto, la dissociazione e la messa in coltura passino tempi differenti.
Una volta stabilito che le cellule neurali fetali sono in grado di moltiplicarsi, è stato anche dimostrato che queste cellule sono in grado di differenziarsi in neuroni, oligodendrociti e astrociti. Per fare questo sono state analizzate cellule in un terreno di coltura privo di citochine, fattori di proliferazione (FGF fibroblast growth factor II, EGF epidermal growth factor). E’ stato osservato che nell’arco di 15 giorni le cellule umane in piastra riescono a differenziarsi (a differenza di quelle murine che si differenziano in una settimana).
Le cellule del tessuto nervoso sono:
neuroni: trasmettono l’impulso nervoso
astrociti: hanno funzione trofica, cioè danno nutrimento ai neuroni
oligodendrociti: circondano i neuroni e vanno a costituire la guaina mielinica, indispensabile per una corretta trasmissione dell’impulso.
Nella SMA le cellule nervose che degenerano sono i motoneuroni che innervano la muscolatura striata scheletrica. Sono state usate quindi particolari sostanze che stimolano la produzione di motoneuroni anziché degli altri due tipi cellulari. Il CTNF (ciliary neurotrophic factor) e il LIF (leucemia inhibitory factor) sono in grado di aumentare il numero di neuroni di due o tre volte.
Con questa tecnica possiamo produrre in vitro le cellule necessarie per un eventuale trapianto per la cura di determinate patologie.
Un altro metodo potrebbe essere quello di trapiantare cellule indifferenziate in un particolare tessuto e attendere che sia il tessuto stesso a stimolare la differenziazione delle cellule.
Per assicurarci che le cellule ottenute siano effettivamente motoneuroni, è necessario individuare la presenza di particolari sostanze tipiche di questo tipo cellulare. L’enzima colinacetiltrasferasi (CAT) è coinvolto nella produzione dell’acetilcolina (neurotrasmettitore necessario per la trasmissione dell’impulso nervoso alla cellula muscolare).
Questo tipo di cellule è stato identificato e ciò è un’ottima base per eventuali trapianti (per adesso solo sugli animali). Non è ancora certo se poi il trapianto nei topi allevierà i sintomi di SMA. Per quanto riguarda la sclerosi multipla è già stato fatto questo esperimento sui topi. Sono state prese cellule staminali di topi sani, coltivate e marcate per farle diventare fluorescenti. Sono stati fatti ammalare topi con particolari metodi, e dopo una quindicina di giorni dal trattamento con fattori che inducono la malattia, sono state iniettate, endovena e direttamente in cavità del sistema nervoso centrale, le cellule marcate. In questo modo è stato possibile evidenziarne la localizzazione anche alcuni mesi dopo il trapianto. I topi trattati hanno mostrato un parziale recupero, in quanto le cellule sono in grado di attecchire nel sistema nervoso centrale.
L’aver ritrovato queste cellule a distanza di mesi, è importante, ma cosa ancora più importante è il fatto che esse si siano differenziate in cellule neurali. Infatti le cellule marcate esprimono sostanze tipiche dei neuroni, degli oligodendrociti e degli astrociti: quindi l’organismo ha spinto le cellule staminali a differenziarsi in cellule adulte. Esse sono in grado, oltre che di sostituire le cellule morte, anche di ridurre le cicatrici sugli assoni che potrebbero impedire la trasmissione dell’impulso. Gli animali a cui sono state iniettate le cellule staminali sopravvivono per un tempo più lungo rispetto a quelli che non hanno ricevuto il trattamento, e hanno minori problemi motori.
(Articolo tratto dal II° Semestrale ASAMSI 2003)
2002
Progetto preliminare per la valutazione dell’utilizzo di cellule staminali cerebrali umane nella cura dell’ atrofia muscolare spinale.
La malattia nota come atrofia muscolare spinale (SMA), è una situazione patologica in cui si verifica una perdita di tessuto muscolare secondaria ad un danno primario che coinvolge i motoneuroni e che è essenzialmente causata da una mutazione nel gene SMN1, coinvolto nel metabolismo dell’ RNA messaggero nei motoneuroni. Questa bozza riguarda un progetto esplorativo per valutare la possibilità di utilizzare cellule staminali cerebrali umane, naive o ingegnerizzate geneticamente, per prevenire la degenerazione di motoneuroni o, in alternativa, per generare nuovi motoneuroni da utilizzare per futuri trapianti finalizzati a ricostruire circuiti nervosi a lungo percorso, quali appunto quelli dei motoneuroni.
Le cellule staminali somatiche sono cellule altamente indifferenziate e multipotenti, dotate della capacità di automantenimento e autorinnovamento, ovvero in grado di moltiplicarsi indefinitamente. Queste cellule possono essere isolate da diversi tessuti ed organi, sia negli organismi in fase di sviluppo sia negli organismi adulti.
Le cellule staminali somatiche di derivazione cerebrale, ed in particolare quelle umane, sono in grado di proliferare in coltura per tempi indefiniti, mantenendo inalterate le loro proprietà. Queste cellule umane sono state isolate per la prima volta dal nostro laboratorio e sono già disponibili. Esse hanno quindi la capacità tipica delle cellule staminali somatiche di dare origine alle cellule mature, in questo caso cerebrali, vale a dire neuroni, astrociti ed oligodendrociti. Tutto ciò equivale a dire che il nostro gruppo ha a disposizione una sorgente illimitata, rinnovabile e standardizzata di cellule cerebrali umane che possono essere utilizzate per trapianti intracerebrali
Tentativamente, questo progetto si articola lungo due linee principali. La prima fase prevede lo sviluppo di una tecnica che permetta di “istruire” le cellule staminali in modo tale che quando il loro differenziamento a produrre neuroni viene indotto, tali neuroni assumano l’identità di motoneuroni umani. Questi potrebbero poi venire utilizzati per il trapianto nel midollo spinale, inserendosi in un progetto di più ampia portata che il nostro gruppo sta sviluppando, e che prevede la ricostruzione di vie nervose a lunga percorrenza. Questa fase del progetto prende origine dal fatto che durante lo sviluppo embrionale, la specificazione del fenotipo motoneuronale viene acquisita solo in una fase tardiva del ciclo cellulare delle cellule dette progenitori ad opera di segnali estrinseci (esterni alla cellula) che, per i motoneuroni, provengono dalle zone assiali e parassiali del mesoderma e che sono in parte stati identificati.. Infatti, alcune di queste molecole che agiscono da induttori sono oggi conosciute e nella letteratura scientifica sono già stati riportati esperimenti di induzione in vitro. Le molecole che noi vorremmo utilizzare inizialmente per tale scopo sono: l’acido retinoico e il retinolo ed alcune citochine quali il leukaemia inhibitory factor (LIF) ed il Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF).
In breve, gli esperimenti pilota potrebbero procedere come segue: le cellule staminali neurali da noi coltivate vengono noirmalmente fatte crescere ed espandere in un terreno di coltura contenente EGF (epidermal grow factor) e FGF2 (fibroblast grow factor2). Il processo di differenziamento che porta alla generazione di neuroni, astrociti ed oligodendrociti a partire dalle cellule staminali, avviene mediante rimozione dell’ FGF2 e dell’ EGF dal mezzo di coltura. Quindi, l’induzione del fenotipo colinergico degli ?-motoneuroni avverrà come appena descritto, ma esponendo le cellule differenzianti a LIF, CNTF o anche ad altre sostanze inducenti quali sonic hedgehog ed altre ancora. La nostra idea è quella di testare, per ogni molecola presa in esame, la possibile azione induttiva attraverso esperimenti di analisi del profilo di sviluppo temporale, in cui verrà considerata l’azione induttiva dei vari fattori, anche in combinazione, a diverse concentrazioni e a tempi diversi durante il processo differenziativo delle cellule staminali cerebrali umane, considerando come tempo zero l’inizio del processo differenziativo corrispondente alla rimozione dei fattori di crescita. La verifica della induzione del fenotipo colinergico verrà effettuata tramite analisi sull’RNA estratto dalle cellule attraverso reazioni di RT-PCR per individuare la presenza dell’RNA messaggero codificante per i geni specifici dei neuroni colinergici. Inoltre attraverso analisi immunocitochimica sulle cellule differenziate verificheremo l’effettiva espressione di tali proteine utilizzando anticorpi specifici contro l’enzima colina acetil-transferasi (ChAT), il trasportatore di acetilcolina (VAChT), l’enzima acetil-colinesterasi (AChE) e contro il neuropeptide vaso attivo (VIP) che caratterizzano gli ?-motoneuroni, anche in concomitanza con l’espressione di recettori per fattori neurotrofici che favoriscono la sopravvivenza di motoneuroni (i.e. per il GDNF o l’NGF).
Una visualizzazione più rapida dell’avvenuta acquisizione di un possibile fenotipo colinergico potrebbe inoltre essere ottenuta utilizzando cellule staminali neurali provenienti da topi transgenici Thy1-CFP. Questi topi esprimono nei neuroni motori e sensoriali, ad elevati livelli, una proteina fluorescente visibile nello spettro di assorbimento del giallo visualizzabili attraverso microscopia a fluorescenza. I topi sono disponibili nel nostro laboratorio. Una volta messo a punto il sistema più efficace per indurre il fenotipo colinergico nelle cellule staminali neurali provenienti da topo adulto pensiamo di passare ad una seconda fase di studi che preveda un approccio in vivo trapiantando le cellule indotte ma non terminalmente differenziate, cioè ancora in via di differenziamento, in topi affetti da SMA.
In una seconda fase, parallela alla prima, intendiamo utilizzare cellule staminali cerebrali umane ingegnerizzate mediante un vettore lentivirale che contiene la cassetta di espressione genica per il Glial Derived Neurotrofic Factor (GDNF), noto supportare la sopravvivenza dei motoneuroni. Queste cellule sono già pronte nel nostro laboratorio ed intendiamo utilizzare una tecnica innovativa di trapianto che permette la diffusione di queste cellule ingenerizzate in modo generalizzato nel sistema nervoso di topi SMA. Verrà quindi analizzata la capacità di queste cellule ingegnerizzate di prevenire la morte dei motoneuroni. In questi animali, dato l’uso di cellule umane, sarà necessaria l’immunosppressione. Risulta evidente come, utilizzando noi cellule umane, qualunque risultato positivo potrebbe essere trasferito rapidamente alla fase preclinica/clinica.
Il costo complessivo per un anno di progetto si aggira sui 50.000-70.000€. Parte dei fondi verranno stornati da altri progetti già attivi presso il nostro laboratorio. Si richiede una borsa di studio di 15.000 € per il Dr. Visioli Alberto che si occuperà esclusivamente di avviare questo progetto.
(Autore: Dr. Angelo L. Vescovi)
|
