Settembre 2007
Ripristino della proteina funzionale SMN in cellule mES derivate da modelli murini SMA
(Smn-/-/hSMN2) mediante la tecnica dell’ S.F.H.R. (Small Fragment Homologous Replacement)
Laboratorio di Genetica Medica, Università di Tor Vergata, Roma, direttore Prof. Giuseppe Novelli

L’Atrofia Muscolare Spinale è una patologia neuromuscolare, a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata dalla degenerazione degli α-motoneuroni. Circa il 94% dei soggetti affetti da SMA risultano deleti in omozigosi per il gene SMN1. La copia centromerica SMN2, produce principalmente una proteina non funzionale a causa di un fenomeno di splicing alternativo dovuto ad una transizione C>T nell’esone7. Per questo motivo l’esone7 di SMN2 è considerato un target terapeutico per una possibile cura della SMA. Ad oggi non esiste un trattamento terapeutico risolutivo per questa malattia.
  In questo studio, ci proponiamo di testare una tecnica non virale di terapia genica, denominata S.F.H.R.  (Small Fragment Homologous Replacement) su cellule staminali embrionali murine (mES) ottenute da modelli murini affetti da SMA (Smn-/-;SMN2).
Mediante questo protocollo di gene targeting è possibile modificare stabilmente la sequenza nucleotidica di interesse, mantenendo inalterata l’organizzazione genomica necessaria per                        l’espressione e la regolazione fisiologica della cellula target.
L’applicazione di tale tecnica non virale è finalizzata alla conversione del gene umano SMN2 in SMN1: il gene funzionale. In particolare, abbiamo indotto la transizione T>C  nell’esone 7 del gene SMN2 in modo tale da produrre un aumento della proteina funzionale SMN.
A tale scopo sono stati trasfettati frammenti di DNA di 837bp omologhi alla sequenza dell’esone 7 del gene SMN1. Nelle cellule mES trasfettate è stata valutata la conversione del gene SMN2 in SMN1 mediante analisi molecolare (DNA - mRNA e proteina).
Le cellule SMA trasfettate, analizzate mediante Real-Time PCR, hanno mostrato un incremento dell’mRNA full-lenght (FL-SMN) rispetto all’isoforma ∆7SMN fino al 70% con un decremento del 14% dell’isoforma ∆7SMN. Inoltre, esperimenti di immunoistochimica hanno evidenziato un incremento del numero di “gems” nelle cellule trattate rispetto a quelle non trattate (92.3 gems ogni 100 cloni). Questi risultati dimostrano la possibilità di ripristinare livelli funzionali della proteina SMN, in cellule  embrionali staminali murine attraverso la modificazione               sito-specifica del DNA genomico, suggerendo un potenziale uso di questa tecnica per la correzione del fenotipo SMA.
Successivamente, le cellule corrette saranno differenziate in vitro in motoneuroni per verificare la loro funzionalità.
Questo progetto è coordinato dal Prof. G. Novelli e la Prof.ssa F. Sangiulo e realizzato dal Dr. A. Filareto e dalla Dr.ssa A. Malgieri.

Dicembre 2006
APPROCCI DI TERAPIA GENICA INNOVATIVI PER L’ ATROFIA MUSCOLARE SPINALE (SMA) UTILIZZANDO CELLULE STAMINALI EMBRIONALI MURINE.
Università degli Studi “Tor Vergata” di Roma
Dipartimento di Biopatologia e Diagnostica per Immagini –Sezione di Genetica

SOMMARIO
L’Atrofia Muscolare Spinale è una patologia neuromuscolare, a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata dalla degenerazione degli a-motoneuroni. Circa 94% dei soggetti affetti da SMA risultano deleti in omozigosi per il gene SMN1. La copia centromerica SMN2, produce principalmente una proteina non funzionale a causa di un fenomeno di splicing alternativo dovuto ad una transizione C→T nell’esone7.  Per questo motivo l’esone7 di SMN2 è considerato un target terapeutico per una possibile cura della SMA. Ad oggi non esiste un trattamento terapeutico risolutivo per questa malattia.
Il programma di ricerca prevede l’applicazione di una tecnica non virale di terapia genica chiamata SFHR (Small Fragment Homologous Replacement) finalizzata alla conversione del gene umano SMN2 in SMN1 (copia funzionale), al fine di ripristinare livelli funzionali di proteina SMN full-length. A tale scopo saranno trasfettati frammenti di DNA “terapeutico” di 498bp (sintetizzati in vitro) omologhi all’esone7 del gene SMN1 Per gli esperimenti saranno utilizzate cellule staminali embrionali ottenute dal modello murino SMA (Smn -/-,SMN2+/+). Successivamente le cellule corrette saranno differenziate in vitro in motoneuroni e le cellule corrette trapiantate in topi neonati affetti da SMA al fine di testare le loro capacità di ripristino del fenotipo selvatico. Le cellule staminali embrionali murine derivano dal topo knockout SMA in nostro possesso dopo richiesta al Prof. Arthur Burghes (Ohio, USA). Questi modelli murini transgenici da lui sviluppati sono privi delle copie dei gene Smn murino, mentre contengono nel loro genoma due copie del gene SMN2 umano. Questo modello animale riproduce strettamente il difetto patologico che caratterizza i pazienti SMA e pertanto rappresenta un ottimo modello di studio per esperimenti di terapia genica in vivo ed ex vivo.
Di redente nel nostro laboratorio è stata applicata con successo la tecnica di gene targeting SFHR: ripristinando livelli funzionali di proteina SMN in cellule fetali umane prelevate da un paziente affetto da SMA.

LA MALATTIA
Le atrofie muscolari spinali (SMA) sono un gruppo eterogeneo di patologie neuromuscolari, caratterizzate da degenerazione dei motoneuroni delle corna anteriori del midollo spinale. Le forme a trasmissione autosomica recessiva sono state classificate in tre tipi, sulla base dell’età dell’insorgenza, la capacità motoria e l’aspettativa di vita. La SMA di tipo I è la forma più grave ed è caratterizzata da grave debolezza muscolare ed ipotonia. La SMA di tipo II è la forma intermedia; i pazienti non sono in grado di stare in piedi né di camminare senza aiuto. La SMA di tipo III è la forma più lieve, cronica. La SMA è una delle più diffuse malattie genetiche dell’infanzia, a trasmissione autosomica recessiva, con un’incidenza di 1 su 6000 e una frequenza di portatori sani pari a 1 su 40. La regione cromosomica 5q13, dove mappa il locus malattia, presenta infatti una elevata complessità ed instabilità genomica dovute alla presenza di ampie regioni duplicate che coinvolgono diversi geni e pseudogeni. E' stato ormai definitivamente chiarito che la patogenesi della malattia è riconducibile alla perdita in omozigosi nei pazienti della copia telomerica del gene SMN (Sopravvivenza del MotoNeurone), deleto in maniera specifica nei cromosomi dei pazienti SMA. In circa il 94% dei pazienti affetti da SMA è assente in omozigosi il gene SMN1 (survival motor neuron gene), e questa delezione causa una degenerazione specifica a carico degli -motoneuroni del midollo spinale. La proteina SMN è parte di un complesso in cui sono coinvolte più molecole, chiamato SMN, che svolge un ruolo fondamentale nell’assemblaggio delle ribonucleoproteine (snRNPs). Inoltre i pazienti SMA presentano almeno una copia del gene duplicato SMN2, che agisce come modulatore positivo del fenotipo clinico. SMN2 è praticamente identico a SMN1 ma differisce per il pattern di splicing infatti produce circa il 90% di un trascritto privo dell’esone 7 che per questo motivo codifica per una proteina instabile dal punto di vista biochimico. La copia centromerica del gene, detta SMN2, presenta un'unica differenza critica rispetto ad SMN1 che ne altera lo splicing. La maggior parte dei trascritti di SMN1 contiene i 9 esoni del gene, mentre la maggior parte dei trascritti prodotta da SMN2 manca dell’esone 7. Esiste una relazione inversa tra il numero delle copie di SMN2 e la gravità dell’atrofia muscolare spinale, è stato infatti dimostrato che nei pazienti SMA di tipo II e III è presente un maggior numero di copie del gene SMN2 rispetto ai pazienti SMA di tipo I. Diverse strategie sono state messe in atto per incrementare la produzione della proteina SMN nelle cellule di pazienti SMA, inclusa la terapia genica e l’uso di farmaci o oligonucleotidi antisenso capaci di prevenire lo “skipping” dell’esone 7 nel trascritto SMN2 agendo a livello del processo di splicing.
La modulazione del fenotipo è probabilmente dovuta alla minima quantità di trascritto "completo" che il gene SMN2 riesce comunque a produrre. Questa evidenza è stata confermata anche da studi su modelli murini di SMA, nei quali è stata osservata un' attenuazione del fenotipo clinico in relazione all'induzione dell'espressione di extra copie del gene SMN2. Su questa evidenza sperimentale si basa il nostro programma di ricerca che prevede l’applicazione di due diversi approcci di terapia genica.
Se i protocolli di terapia molecolare proposti avranno successo nel riportate i livelli di espressione a quelli normali in cellule derivanti da pazienti SMA e nel modello animale, si potrà pensare di applicarne l’uso come terapia a lungo termine per i feti affetti (terapia genica in utero) e nei bambini affetti da questa grave malattia. Inoltre i risultati potranno costituire un modello per lo sviluppo di ricerche di terapia con cellule staminali anche per altre patologie del midollo spinale come la sclerosi laterale amiotrofica e le lesioni acquisite.

LA TECNINCA SFRH
Nell’ambito dei diversi protocolli sperimentali di terapia genica, la tecnica SFHR (Small Fragment Homologous Replacement) risulta potenzialmente di grande interesse per vari motivi: non prevede l’impiego di sequenze virali, né di gene di supporto esogeni e/o di promotori o di induttori di ricombinazione di diversa natura biologica, in quanto utilizza frammenti di DNA di circa 500-700 nucleotidi sintetizzati in vitro, che una volta introdotti nella cellula sono in grado di effettuare la sostituzione omologa “mirata” unicamente al gene di interesse.
Questo processo ricombinativo avviene probabilmente durante la fase di replicazione del DNA attraverso un meccanismo tuttora sconosciuto. Questa metodica e’ stata inizialmente utilizzata dal nostro gruppo e da altri con successo in vitro e in vivo per la correzione di mutazioni responsabili di patologie monogeniche quali la Fibrosi Cistica, la distrofia muscolare di Duchenne, l’anemia falciforme e la SCID.
Attraverso questo protocollo è possibile modificare stabilmente la sequenza nucleotidica del DNA, mantenendo nello stesso tempo inalterata l’organizzazione genomica necessaria per la sua fisiologica espressione e regolazione. La recente applicazione di questa tecnica alle cellule staminali ha dimostrato la possibilità di utilizzare questo tipo di cellule per sviluppare approcci di terapia genica ex vivo finalizzati al trattamento di patologie umane come la SMA, per cui fino ad oggi trattamenti convenzionali non hanno dato alcun esito positivo. Inoltre è stato ormai dimostrato che le cellule embrionali possono differenziare in vitro e in vivo in motoneuroni funzionali

IL PROGETTO
Le cellule staminali murine (Smn-/-,SMN2+/+) saranno trasfettate con frammenti di DNA terapeutico omologhi all’esone 7 del gene SMN1. Nelle cellule trasfettate sarà valutata (mediante analisi su DNA – mRNA – proteina) la conversione del gene SMN2 in SMN1 e successivamente le cellule corrette saranno differenziate in motoneuroni.

 OBIETTIVI e TEMPI DI REALIZZAZIONE

                PRIMO ANNO

                SECONDO ANNO

                PROSPETTIVE FUTURE

Luglio 2005
Ripristino in vitro della proteina SMN funzionale in trofoblasti umani affetti da atrofia muscolare spinale tramite la tecnica "Small Fragment Homologous Replacement”.
Sangiuolo F, Filareto A, Spitalieri P, Scaldaferri ML, Mango R, Bruscia E, Citro G, Brunetti E, De Felici M, Novelli G.
Human Genetics Section, Department of Biopathology, Tor Vergata University, 00133 Rome, Italy.

Nel laboratorio di Genetica dell’Università Tor Vergata è stato messo a punto un protocollo innovativo di terapia genica non virale finalizzato a curare le Atrofia Muscolare Spinale (SMA).
La malattia colpisce 1 bambino ogni 6000 nati e si trasmette da genitori portatori della patologia, ma asintomatici. Nel 95% dei pazienti manca il gene SMN1 “Survival Motor Neurons” SMN su entrambi i cromosomi e questo fenomeno causa a sua volta una drastica riduzione di proteina funzionale, che causa degenerazione dei motoneuroni della corda spinale, con conseguente atrofia muscolare e progressiva paralisi agli arti e al tronco.
La terapia genica somatica è una tecnica di ingegneria genetica che mira alla correzione di un difetto genetico di base attraverso il trasferimento di materiale genetico esogeno funzionale nelle cellule. In questo modo si fornisce alle cellule l’esatta informazione genica, ristabilendo la normale struttura e il corretto funzionamento della proteina nelle cellule mutate. Nel nostro caso la tecnica prevede l’introduzione all’interno delle cellule SMA di frammenti di DNA “terapeutico” iniettati direttamente nel nucleo, mediante la tecnica della microiniezione. La modificazione del DNA è specifica e permanente, rispettando nello stesso tempo l’integrità del gene e i meccanismi fisiologici cellulari. L’approccio terapeutico innovativo si è mostrato in grado di ripristinare in laboratorio -in vitro- livelli fisiologici di proteina SMN funzionale paragonabili a quelli presenti in cellule normali. L’esperimento è stato condotto in cellule di trofoblasto fetale affette da SMA e prelevate alla XII settimana di gravidanza. Le cellule trattate con il frammento di DNA “terapeutico” mostrano un incremento di proteina funzionale pari a due volte che rimane inalterato nel tempo dimostrando la sua stabilità.
I risultati di questa ricerca potranno fornire un contributo importante per la messa a punto di un protocollo di terapia genica su pazienti affetti da forme medio/lievi di SMA, modulando il fenotipo patologico nei soggetti affetti dalla malattia.

Novembre 2003
La tecnica SFHR (small fragment homologous replacement) nella terapia genica dell'atrofia muscolare spinale (SMA)
Prof. Giuseppe Novelli
Università degli Studi “Tor Vergata” di Roma - Dipartimento di Biopatologia e Diagnostica per Immagini

Lo scopo di questo progetto è la messa a punto di un protocollo di terapia genica, basato su una tecnica di “gene targeting” chiamata SFHR, per la correzione di mutazioni responsabili di patologie monogeniche quali le Atrofie Muscolari Spinali (SMA). La tecnica SFHR (Small Fragment Homologous Replacement), sviluppata nel nostro laboratorio, rappresenta un protocollo sperimentale di terapia genica innovativo, in quanto utilizza frammenti di DNA di circa 500-700 nucleotidi sintetizzati in vitro, che una volta introdotti nella cellula sono in grado di effettuare la sostituzione omologa “mirata” unicamente al gene di interesse, senza l'utilizzo di sequenze virali.
Le atrofie muscolari spinali (SMA) sono un gruppo eterogeneo di patologie neuromuscolari, caratterizzate da degenerazione dei motoneuroni delle corna anteriori del midollo spinale.
Nella regione cromosomica 5q13, dove mappa il locus malattia, sono presenti ampie regioni duplicate che coinvolgono diversi geni e pseudogeni. Il gene responsabile della SMA (copia telomerica di SMN) risulta deleto in omozigosi nei soggetti affetti, mentre la copia centromerica del gene, detta SMN2, presenta un'unica differenza critica rispetto ad SMN1 che causa in SMN2 un'alterazione del processo di splicing.

Premessa
La terapia genica è una tecnica di ingegneria genetica che mira alla correzione di un difetto genetico attraverso il trasferimento di materiale genetico esogeno funzionale nelle cellule utilizzando vettori specifici. In questo modo si fornisce alle cellule l’esatta informazione genica, ristabilendo la normale struttura e il corretto funzionamento della proteina nelle cellule mutate. La tecnica SFHR (Small Fragment Homologous Replacement) risulta potenzialmente di grande interesse in quanto non prevede l’impiego di sequenze virali, di gene di supporto esogeni e/o di promotori o di induttori di ricombinazione di diversa natura biologica, ma utilizza frammenti di DNA sintetizzati in vitro, in grado di effettuare la sostituzione omologa del solo gene di interesse (6,7). Questa metodica e’ stata inizialmente utilizzata nel nostro laboratorio con successo in vitro su linee cellulari di epitelio respiratorio umano per la correzione di una mutazione responsabile della più comune malattia autosomica recessiva letale nella prima infanzia, la Fibrosi Cistica (FC; MIM* 219700) (8-10). Questo esperimento ha dimostrato per la prima volta la possibilità che le cellule di mammifero sono in grado di integrare in modo specifico sequenze omologhe esogene somministrate mediante vettori lipidici. Noi abbiamo recentemente dimostrato che l’efficienza di transfezione è strettamente dipendente dalla lunghezza del frammento “terapeutico”, dalla concentrazione lipidi/DNA, dal tipo cellulare, dalla fase cellulare e, soprattutto, dalle caratteristiche intrinseche del gene da “correggere”. In particolare risulta l'efficienza di correzione risulta aumentata se la regione interessata è altamente ricombinogenica. E' questo uno dei motivi per cui pensiamo ad un impiego clinico di questa tecnologia per la SMA.
La regione cromosomica 5q13, dove mappa il locus malattia, presenta infatti una elevata complessità ed instabilità genomica dovute alla presenza di ampie regioni duplicate che coinvolgono diversi geni e pseudogeni. E' stato ormai definitivamente chiarito che la patogenesi della malattia è riconducibile alla perdita in omozigosi nei pazienti della copia telomerica del gene SMN (Sopravvivenza del MotoNeurone), deleto in maniera specifica nei cromosomi dei pazienti SMA. La copia centromerica del gene, detta SMN2, presenta un'unica differenza critica rispetto ad SMN1 che ne altera lo splicing. La maggior parte dei trascritti di SMN1 contiene i 9 esoni del gene, mentre la maggior parte dei trascritti prodotta da SMN2 manca dell’esone 7. Esiste una relazione inversa tra il numero delle copie di SMN2 e la gravità dell’atrofia muscolare spinale, è stato infatti dimostrato che nei pazienti SMA di tipo II e III è presente un maggior numero di copie del gene SMN2 rispetto ai pazienti SMA di tipo I. La modulazione del fenotipo è probabilmente dovuta alla minima quantità di trascritto "completo" che il gene SMN2 riesce comunque a produrre. Questa evidenza è stata confermata anche da studi su modelli murini di SMA, nei quali è stata osservata un' attenuazione del fenotipo clinico in relazione all'induzione dell'espressione di extra copie del gene SMN2. Su questa importantissima evidenza sperimentale si basa il nostro progetto di ricerca: la correzione che ci prefiggiamo di indurre in vitro è proprio a carico del gene SMN2, che verrà modificato in modo da produrre esclusivamente trascritti contenenti l'esone 7.

Obiettivo della ricerca:
Gli obiettivi di questo studio sono i seguenti:
- Conversione in vitro, attraverso la tecnica SFHR, del gene SMN2 in SMN1 (copia funzionale) in linee cellulari umane delete in omozigosi per il gene SMN1 e in linee di controllo.
- Mutagenizzare in vitro il gene SMN nel topo in cellule murine embrionali staminali, in modo da ridurre la quantità di trascritto e di proteina funzionale.
- Effettuare esperimenti in vivo su modelli murini affetti da SMA, per ottenere un ripristino, anche parziale, del fenotipo attraverso il trapianto di cellule staminali “corrette” in vitro.

(Autore: Prof. Giuseppe Novelli)

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